Cas12 سرگرمی کا ٹیون ایبل کنٹرول یونیورسل اور تیز ترین ایک-پاٹ نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کو فروغ دیتا ہے
شائع کردہ: یونیورسٹی آف سائنس اینڈ ٹیکنالوجی آف چائنہ
جرنل: نیچر کمیونیکیشنز
اثر کا عنصر: 14.7
MIRA ٹیکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے، سوڈیم ہیپرین پر مبنی ایک یونیورسل ون-پاٹ فلوروسینٹ نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کا طریقہ (سروے) تیار کیا گیا۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ سوڈیم ہیپرین Cas12a-crRNA بائنڈنگ کے عمل میں مداخلت کرکے Cas12a کلیویج کی سرگرمی کو منظم کر سکتا ہے۔ سوڈیم ہیپرین کے ارتکاز کو ایڈجسٹ کرتے ہوئے، سروے کلاسک اور سب سے زیادہ PAM دونوں ترتیبوں کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے اور متعدد Cas12 ذیلی قسموں پر لاگو ہوتا ہے۔ یہ طریقہ، صرف 15-20 منٹ کے پتہ لگانے کے وقت کے ساتھ، مونکی پوکس سیوڈو وائرس، انفلوئنزا اے وائرس، اور سارس-CoV-2 کا پتہ لگانے کے لیے 95 فیصد سے زیادہ حساسیت اور مخصوصیت حاصل کرتا ہے۔ یہ کم لاگت-ہے اور روایتی CRISPR تشخیص میں حساسیت اور مخصوصیت کے درمیان مشکل توازن کو دور کرتے ہوئے، طبی میدان کی تشخیص اور ماحولیاتی نگرانی کے لیے ایک نیا، نقطہ نظر کا پتہ لگانے کا طریقہ فراہم کرتا ہے۔
1. ہیپرین سوڈیم کے عمل کے طریقہ کار پر مطالعہ کریں۔
10nM ہدف والے DNA پر مشتمل Cas12a-crRNA سسٹم میں فلوروسینٹ پروب شامل کی گئی، اور سوڈیم ہیپرین کے اضافے کے بغیر ایک تیز اور اہم فلوروسینٹ سگنل دیکھا گیا۔ جب 0.2ug/ml سوڈیم ہیپرین کو شامل کیا گیا، تو فلوروسینٹ سگنل کنٹرول گروپ سے ملتا جلتا تھا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ سوڈیم ہیپرین نے ٹرانس-Cas12a{7}}ug/mL کی ٹرانس-کلیویج سرگرمی کو روکا ہے سوڈیم ہیپرین کی کم سے کم روک تھام ہے۔ جیسے ہی سوڈیم ہیپرین کا ارتکاز 0.2ug/mL سے 0.5ug/mL تک بڑھ جاتا ہے، Cas12a کی cis-کلیویج سرگرمی آہستہ آہستہ روک دی جاتی ہے، اور 0.5ug/mL پر، ٹرانس-کلیویج سرگرمی تقریباً مکمل طور پر روک دی جاتی ہے۔ سوڈیم ہیپرین کے عمل کے طریقہ کار پر ہونے والے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ سوڈیم ہیپرین کے منفی چارج شدہ گروپس سی آر این اے کے Cas12a کے صحیح پابند ہونے میں مداخلت کرتے ہیں، اور crRNACas12a بائنری کمپلیکس کی تشکیل کو متاثر کر سکتے ہیں۔
- MIRA-Cas12a one-pot detection
سوڈیم ہیپرین کے عمل کے طریقہ کار کی توثیق کرنے کے بعد، کاغذ نے ایک ہی ٹیوب میں MIRA ایمپلیفیکیشن اور Cas12a-ثالثی فلوروسینس کا پتہ لگانے کو ملا کر ایک-برتن کا پتہ لگانے کی حکمت عملی (MIRA-Cas12a) کی کھوج کی۔
سوڈیم ہیپرین کی عدم موجودگی میں، MIRA-Cas12a کے امتزاج نے 0.1aM سے 10fM کے ہدف کے جین کے ارتکاز کی حد کے اندر کوئی اہم فلوروسینس سگنل پیدا نہیں کیا۔ سوڈیم ہیپرین کے 40µg/mL پر، 1aM (≈0.6 کاپیاں/μL، حجم=30μL) سے لے کر 10fM (≈6,000 copies/μL، حجم=30)، حجم=30، 00dμL میں بہتری کے ہدف کے ارتکاز کی حد میں ایک اہم فلوروسینس سگنل دیکھا گیا۔ سوڈیم ہیپرین کے بغیر نظام کے مقابلے میں حساسیت کا پتہ لگانا۔
مانکی پوکس وائرس ٹیمپلیٹ کا ارتکاز 10 fM تھا، اور Cas12a-crRNA (100 nM) کو ہدف والے جین f31 اور b6r کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ایمپلیفیکیشن ری ایکشن کو 0، 2، 4، 6، 8، 12، 16، اور 20 منٹ پر ختم کیا گیا اور مختلف اوقات میں MIRA ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ کے مواد کا تجزیہ ایگرز جیلوں پر کیا گیا۔ اس کے بعد نتیجے میں آنے والی مصنوعات کا تین مختلف ترتیبات کے تحت ایگرز جیلوں پر تجزیہ کیا گیا: MIRA-Cas12a کے بغیر ہیپرین سوڈیم، MIRA-Cas12a بغیر ہیپرین سوڈیم کے، اور MIRA-Cas12a ہیپرین سوڈیم کے ساتھ۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ہیپرین سوڈیم کی عدم موجودگی میں، Cas12a کی اعلیٰ cis-کلیویج سرگرمی کی وجہ سے نیوکلک ایسڈ کی افزائش میں رکاوٹ تھی۔ تاہم، ہیپرین سوڈیم کے اضافے نے Cas12a کی cis-کلیویج سرگرمی میں کمی کی وجہ سے نیوکلک ایسڈ کی افزائش میں نمایاں اضافہ کیا۔
مضمون یہ ظاہر کرتا ہے کہ سوڈیم ہیپرین پر مبنی ایک یونیورسل ون-پاٹ فلوروسینٹ نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کا طریقہ (سروی) کلاسک PAM اور suboptimal PAM دونوں ترتیبوں کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا جا سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، LbCas12a کے علاوہ AsCas12a اور AapCas12b بھی CRISPR-Dx طریقوں میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتے ہیں۔ MIRA-AsCas12a استعمال کرنے والے نظام میں، فلوروسینس صرف 40ug/mL سوڈیم ہیپرین کی موجودگی میں دیکھا گیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ یہ f31 اور b6r جینز کے 1fM کا پتہ لگا سکتا ہے۔ سوڈیم ہیپرین کی عدم موجودگی میں، MIRA-AapCas12b 1 f31 اور b6r جین کا پتہ لگا سکتا ہے۔ 20ug/mL سوڈیم ہیپرین کے استعمال نے نہ صرف MIRA-AapCas12b کی کھوج کی شرح کو تیز کیا، بلکہ فلوروسینس کی شدت کو بھی بڑھایا۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ سوڈیم ہیپرین کی خوراک کا استعمال کرتے ہوئے تیار کردہ ایک برتن کا طریقہ دیگر Cas12 ذیلی قسموں پر بھی لاگو ہوتا ہے۔
